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(§以下技術問與答由長庚余兆松團隊所提供)

蛋白質體學技術問答整理

Q1:進行蛋白質二維膠體電泳分析時,需要多少蛋白量?

A1:150μg protein for silver staining。
500μg protein for coomassie blue staining。

Q2:蛋白質二維膠體電泳分析時,檢體需注意甚麼?

A2:檢體中鹽類含量太多會影響電泳分離,含量較高的蛋白(abundant protein)會有遮蔽現象。

Q3:如何利用蛋白質一維膠體電泳配合質譜鑑定(1D GeLC-MS/MS)以達到最佳效果?

A3:將60μg的複雜樣品利用6%~16%的12公分梯度蛋白質一維膠體電泳分離,dye front跑至最底部但不跳海,計算每條marker間的距離,依照距離比例將整條lane切成40~60等份,最後每等份再切成四份,只取中間兩份(約1 mm3/gel)進行膠體內蛋白質水解與萃取水解後胜肽提供液相層析質譜儀分析。

Q4:如何挑選accurate inclusion mass screening (AIMS)的目標水解胜肽(挑選的重要次序)?

A4:1.unique peptide(專屬於特定蛋白質的水解後胜肽)、2.胜肽序列已完全水解切割、3. 不能有M, C, W造成其他胺基酸修飾可能性、4.盡量不要有已知的PTM (在UniProt或HPRD查到)、5.盡量不要有不穩定的胜肽序列如: NG, DG, QG。

Q5:如何用EXCEL計算胜肽中某個胺基酸的數量?

A5:利用函數LEN計算字元數,配合 “取代(SUBSTITUTE)”和相減即可得到儲存格內特定字元的字數。例: =LEN(A1)-LEN(SUBSTITUTE(A1, “p”, “ ”))⇒即可算出A1儲存格中小寫p出現次數。也可計算某字串出現次數,例: ”KP”,算式: =(LEN(A1)-LEN(SUBSTITUTE(A1, “KP”, “ ”)))/LEN(“KP”)⇒即可得到儲存格A1中大寫 “KP”出現次數。

Q6:樣品在進行質譜分析時,發現分析物波峰(peak)的停留時間(retention time)時間延長,可能原因為?

A6:1.Trapping column的壓力太大導致流速降低->解決方式:增加分流的壓力,延長管子長度或使用孔徑較小的管子,使緩衝液盡量流往trapping column但是壓力差不能過大,以免緩衝液滲透至其它valve造成樣品流失。2.Column管路阻塞造成trapping column流速降低流量減少->解決方式:更換新的trapping column。

Q7:減少HPLC管路阻塞的方法?

A7:樣品進樣前必須確定樣品無沉澱物,若有沉澱物則用超音波震盪器盡量將沉澱物粉碎融入緩衝溶液中,最後利用高速離心機13000 rpm離心五分鐘,只取上清液以免吸到沉澱物。

Q8:質譜儀上機進樣量對於蛋白分析是否為越多越好?

A8:否,當樣品進樣量大時,不管是在MALDI-TOF或是LC-ESI-MS分析時,樣品中含量較高的蛋白(abundant protein)會將蛋白量較低的訊號覆蓋住,進而降低蛋白鑑定分析結果。

Q9:為什麼coomassie blue的質譜鑑定结果比銀離子染色的结果好?

A9:銀染的靈敏度較高,得到的蛋白量本來就比較少,加上處理過程中沖洗次數較多,蛋白質的折損也隨著提高,沖洗次數增加同時會造成角質蛋白質(keratin)的汙染影響較大,進而雜訊提高且銀染的過程中使用了福馬林,其會對蛋白做修飾導致酵素切割效率減低,以上各個條件皆會造成鑑定能力低下。

Q10:質譜法蛋白質分析是否可以鑑定到胺基酸序列未知的蛋白質?

A10:由於常見的質譜數據分析的軟體,如Mascot或是SEQUEST都是利用已知的蛋白質序列資料庫進行比對,所以無法比對到未知的蛋白質。當需要對樣品中的可能含有的未知序列的蛋白質或蛋白質資料庫不完整進行鑑定時,建議可採用具有de novo sequencing功能的軟體,可以直接利用目標化合物質譜圖譜上的二級圖譜(MS2)的碎裂片段荷質比(m/z)差值來推估出其胺基酸序列。

Q11:Label-free定量蛋白質體學有何優缺點?

A11:相較於Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)或是stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture (SILAC)等方法需要將樣品利用同位素標定,而label-free定量蛋白質體法則是利用蛋白質水解後胜肽在質譜儀所鑑定到的次數或是鑑定到蛋白質胺基酸的序列涵蓋比例來定量,具有不需將樣品標定和簡單方便處理的優點,但也伴隨著定量的結果可能較不精準的缺點。由於樣品的處理與分析並不是同時進行,可能會有過程中的差異都有可能造成定量結果的誤差。

Q12:何謂targeted proteomics (targeted mass spectrometry)?

A12:針對已知的蛋白質(protein)或胜肽(peptide),利用質譜法進行分析,包含定性或定量的階段;利用AIMS (accurate inclusion mass screening)、SRM (selected reaction monitoring)、MRM (multiple reaction monitoring)等技術,除了可提供較高的偵測靈敏度及速度較快的分析,並可藉由穩定同位素標定的胜肽(stable-isotope labeled peptide)建立減量線(standard curve),提供較為精準的定量結果。

Q13:何謂 SRM、MRM?

A13:SRM (selected reaction monitoring)與MRM (multiple reaction monitoring)主要都是針對”特定質量的分子(selected ion)”利用氣體作撞擊碎裂的”反應 (fragmentation)”後,再針對撞碎後的”特定質量的分子碎片(selected ion fragments)進行掃描偵測”的一種方法;此法主要的優點在於透過兩次針對特定質量的篩選分析(第一次為分子的一級圖譜(MS),第二次為分子撞碎後的二級圖譜(MS2)碎裂片段),可降低掃描到錯誤分子的機率(high specificity),增加對此分子定量的可信度。此實驗通常利用Triple quadrupole 類型的質譜儀來進行分析測量。

Q14:何謂 AIMS (accurate inclusion mass screening)?

A14:AIMS (accurate inclusion mass screening),主要是利用TOF (Time of flight)、Orbitrap或FTICR (Fourier transform ion cyclotron resonance)等類型的質譜儀來進行分析;藉由此類質譜儀可提供”高精準度質量測量(accurate mass)的特性”,結合針對特定精準質量分子進行分析(inclusion mass),可有效掃描(screening)樣品中某些特定的分子是否存在。

Q15:如果想要系統性的尋找特定蛋白質的結合性蛋白質體(interactome),該如何開始?

A15:如果是尋找”內生性特定蛋白質的結合蛋白質體”,建議使用免疫沉澱(immunoprecipitation)以至少10 mg的細胞萃取液,加入< 5μg的專一性辨認該蛋白質的抗體(建議抗體與細胞萃取液比例為1:2000)及適合的瓊脂(如Protein A或Protein G sepharose beads)來進行免疫沉澱。免疫沉澱後的產物建議用SDS-PAGE膠體作分析並進行蛋白質染色後,再將有興趣的bands挖下,利用質譜儀鑑定其蛋白質身分。如果是要尋找特定轉殖入細胞內的含特定標誌蛋白質(tag-fusion protein)的結合性蛋白質,則建議使用至少3 mg轉殖後的細胞萃取液,加入<3μg的專一性辨認該蛋白質的抗體(建議抗體與細胞萃取液比例為1:1000)來進行實驗。

Q16:如果想要系統性尋找特定蛋白質的結合性蛋白質體(interactome)的實驗,該準備哪些control實驗?

A16:在進行免疫沉澱時,要加作一組樣品,即相同量的細胞萃取液加等量的瓊脂,但不加任何抗體(或是加入等量的非專一性抗體),以作為對照組。在進行SDS-PAGE膠體分析免疫沉澱後的產物時,應多增加兩組樣品,分別為等量的專一性辨認該蛋白質的抗體及等量的瓊脂。

Q17:探討細胞外分泌蛋白質體有哪些分析工具可以作為參考依據?

A17:我們可以將質譜儀鑑定得到的蛋白質資料之FASTA檔案利用CBS Prediction Servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/)中的SignalP、SecretomeP以及TMHMM等免費分析軟體來將data進行分類。SignalP可利用胺基酸序列來預測細胞外分泌訊號胜肽的位置並進一步預測蛋白質分泌至細胞外的潛力; SecretomeP則是用來預測不具有細胞外訊號胜肽的蛋白為典型分泌性蛋白的可能性;而TMHMM也是用胺基酸序列來預測蛋白質所含有穿膜區域的數量。除此之外,也可以利用MetaCoreTM- pathway analysis、Proxeon Protein Center或是免付費網站DAVID Bioinformatics Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)進行分析。這些軟體可以幫助我們將鑑定得到的蛋白質於細胞中分布位置進行分類、更可以幫助我們了解這個蛋白質體中有那些訊號傳遞途徑或是細胞功能等可能受到影響。其中MetaCoreTM- pathway analysis的GO Localization更可以將蛋白體於細胞分布位置分類後可能影響的pathway顯示出來,幫助我們針對細胞特定位置的生化途徑進行探究。

Q18:細胞條件培養液中若有某特定蛋白大量存在而影響到二維液相層析串聯質譜儀(2D-LC-MS/MS)的鑑定與定量效果時該怎麼辦?

A18:某些特殊的細胞培養液(如KSFM)中含有某特定蛋白質大量存在,進而覆蓋掉其他蛋白質的訊號時,可能會讓我們得到的蛋白體數量減少,損失珍貴的資訊。為了避免這樣的情形產生,可利用免疫沉澱(immunoprecipitation)或是使用帶有抗體複合物的管柱來移除掉這些特定蛋白質。除此之外,我們也可以先使用控制組樣品來進行一次2D-LC-MS/MS分析,整理此類蛋白質在不同fraction時所會出現的水解後胜肽片段,於後續實驗時輸入這些水解後胜肽為exclusion list進行exclusion MS(不再分析此些訊號),即可降低此類蛋白質對於鑑定分泌蛋白質體的影響。

Q19:micrOTOF-Q 的解析度比MALDI-TOF好嗎?

A19:基本上,儀器本身的靈敏度相差不多,皆可達到10 fmole以下,甚至1 fmole以下,差別在於micrOTOF-Q可搭配 液相層析Liquid-chromatography electrospray ionization (LC-ESI)降低單位時間內分析樣品的複雜度,而MALDI-TOF 若是搭配 二維膠體電泳(2D-electrophoresis)也同樣可降低樣品的複雜度,達到相同的解析度。若樣品複雜度不高,可直接選擇MALDI-TOF,擁有分析迅速及大量分析的優點,但C-ter K的peptide在某些雷射輔助(matrix)環境下較不易被游離(ionization)。

Q20:為何需要 immuno-MRM及如何建立?

A20:當樣品具有高複雜度,及abundant protein干擾時,利用免疫沉澱(immunoprecipitation)將代表性胜肽(surrogate peptide)自複雜樣品中純化出來,對於低含量的目標蛋白質也可同時達到純化的效果。但只適合進行 targeting screening,不適用shotgun analysis discovery。最適合應用在以serum/plasma進行biomarker的驗證。以MRM進樣蛋白量1 μg serum/plasma酵素水解為例,且 serum/plasma 的蛋白質含量約70 mg/ml,直接以MRM進行targeting screening時,相當於進樣<0.02 μl serum/plasma,而immunoMRM則可由2-10 μl甚至更高量的serum/plasma進行免疫沉澱而後進行MRM分析,十分有利於分析血液中的微量蛋白。建立immunoMRM的首要條件需要一個可代表目標蛋白質的水解後胜肽(tryptic peptide)進行免疫沉澱的抗體,同時要考慮此水解後胜肽在MRM質譜儀上可展現較佳的訊號,可由軟體預測或是直接由質譜數據中尋找 suitable tryptic peptide,而目前市面上合乎immunoMRM使用需求的抗體十分少見。其次建立scheduled MRM,針對不同target peptide設定RT, parent ion m/z, fragment ion m/z,若target list中,有相近RT的peptide 則建議拆開成兩個schedule。

Q21:如何進行完善的蛋白質體學質譜法分析(Mass spectrometry (MS)–based proteomics)?

A21:蛋白質體學質譜法分析主要是利用質譜儀的高精準度與快速掃描能力進行蛋白質水解後胜肽的定性及定量,若要彰顯其鑑定能力,務必配合完善地樣品分離及純化,例如複雜蛋白質樣品的多維度分離(如蛋白質膠體電泳、蛋白質等電點分離(Isoelectric focusing, IEF),蛋白質水解後胜肽的多維度分離(如多維度液相層),對於目標蛋白質則可以免疫純化、化學反應純化或親和性方法純化,目標蛋白質水解後胜肽的也可以免疫純化、化學反應純化或親和性方法純化再提供質譜儀分析。

Q22:如何建立新的蛋白質資料庫或新的胺基酸修飾?

A22:資料庫若未建立的目標蛋白質資料時,可先去尋找有無其基因資料庫,若是研究突變後蛋白質也可自行編輯上傳至蛋白質比對軟體伺服器內(如Mascot),同理新的胺基酸修飾,只要知道其化學結構便能自行增加此質量差參數提供比對。

Q23:如何系統性分析特定蛋白質轉譯後修飾(如磷酸化、甲基化或乙烯化)?

A23:蛋白質轉譯若是屬於小分子質量的轉譯後修飾現今多使用專一性抗體進行免疫純化後質譜儀分析,部分轉譯後修飾若可以化學反應產生衍生化提供純化,更將能發展化學純化方法提供後續分析。

Q24:如何挑選定量蛋白體數據中最值得驗證的目標物?

A24:現今定量蛋白質體學數據皆極為龐大,挑選最值得的目標物除了最極端變動族群外,也可觀察是否變化蛋白質皆有相同生物功能(可由生物資訊軟體分析如MetaCoreTM- pathway analysis),同時此蛋白質若具有較多的質譜圖譜鑑定事件也暗示此蛋白質含量較高應該較易被驗證。

Q25:如何純化複雜樣品中的磷酸化胜肽?

A25:純化磷酸化胜肽常用的方法可分為三大類;(1)使用專一性辨認phospho-Serine/Threonine或是phospho-Tyrosine抗體進行免疫沉澱實驗,將複雜樣品中的磷酸化蛋白質水解後胜肽純化出來。過去文獻上有許多研究使用phospho-Tyrosine抗體做純化,可達到不錯的純化效果,但市面上的phospho-Serine/Threonine抗體親和力較弱,因此純化效果有限。(2)使用化學修飾方法,如b-elimination,可將phospho-serine修飾成dehydroalanine,phospho-threonine修飾成b-methyldehydroalanine,接著將其化學修飾成帶有biotin tag,便可以使用avidin進一步將磷酸化胜肽純化出來,但b-elimination對於phospho-Tyrosine沒有作用。(3)使用親和性純化,基於金屬離子如Fe3+, Zn2+ , Ga3+對於磷酸基團有親和力(負電性),進一步將磷酸化胜肽純化出來,此方法稱為IMAC (immobilized metal affinity chromatography)。目前最常使用的方法為TiO2 (Titanium dioxide chromatography),其純化原理類似IMAC,但其可容納磷酸化胜肽量(capacity)較IMAC佳。不同於上述其他兩種方法,親和力純化可全面性地將phospho-serine/threonine/tyrosine同時純化出來,因此為目前最常使用的方法,但此方法對於一些酸性非磷酸化胜肽(含有許多D和E)可能也會有親和力,造成非專一性的結合。

Q26:一般樣品是否可以不經過純化而鑑定磷酸化蛋白質? 經純化後的樣品可以同時鑑定磷酸化蛋白質體和蛋白質體嗎?

A26:在一般樣品中有許多如Heat-shock proteins, structural proteins等abundant proteins,以及帶有磷酸基團的分子如nucleic acid, phospholipid等等,都容易干擾磷酸化蛋白質水解後胜肽的鑑定,若不經純化,雖然仍可鑑定到少數磷酸化蛋白質位點,但可鑑定到的數量將會大幅降低,因此還是建議先經過磷酸化蛋白質的純化後再做偵測。 經由純化之後的樣品可再將留下flow-through 做為蛋白質的鑑定,但若是想要進一步做蛋白質的定量,則不建議此做法,因為蛋白質的定量來自其unique peptides,純化後可能會流失許多胜肽,而造成蛋白質的定量不準確。

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